Técnicas avanzadas de selección espermática

Aproximadamente el 15% de todas las parejas en edad reproductiva tienen problemas de fertilidad, los cuales se resuelven en muchos casos gracias a las Técnicas de Reproducción Asistida (TRA).  A pesar de los avances y desarrollo de estas técnicas en los últimos años, todavía existe un porcentaje de tratamientos fallidos que precisan en ocasiones intentos repetidos para conseguir el embarazo.

En la actualidad el seminograma es la única herramienta aceptada por la OMS (Organización Mundial de la Salud) para evaluar el factor masculino dentro de la infertilidad de pareja. Es una técnica fácil de realizar y que nos brinda mucha información: puede sugerir posibles infecciones, anticuerpos antiespermatozoides, obstrucción del tracto reproductor masculino o estimar el potencial reproductivo a grandes rasgos, pero su valor predictivo para pronosticar las posibilidades de conseguir un embarazo es baja, dados los reportes que existen de hombres con seminograma normal que son infértiles y hombres con seminogramas “anormales” que consiguen embarazos.

Durante la realización de las Técnicas de Selección Espermática (TSE), el objetivo de la preparación y el análisis seminal es conseguir un número suficiente de espermatozoides competentes y con el mayor potencial de fecundación.

Las actuales TSE más utilizadas se basan en las características de movilidad y viabilidad (SWIM UP y CGD), realizando una autoselección para la IUU (Inyección IntraUterina) o la FIV (Fecundación In VITRO); También se pueden basar en la morfología del espermatozoide donde se realiza una selección subjetiva de los espermatozoides directamente por el embriólogo como en la ICSI (Inyección IntraCitoplasmática).

En el SWIM UP (SU) se realiza una centrifugación muy suave que recupera aquellos espermatozoides maduros y activados. Presenta algunos inconvenientes: recupera solo un máximo del 10% de la población total de espermatozoides disponibles para su posterior uso y si las muestras no se centrifugan con cuidado puede que muchas células móviles de los sedimentos se anclen al fondo del tubo y nunca puedan llegar a la capa de medio de cultivo.

La Centrifugación por Gradientes de Densidad (CGD) utilizado en muestras con elevada viscosidad o con elevado número de células redondas, la separación se produce en función de la densidad y motilidad de los espermatozoides: los más rápidos migrarán al fondo del tubo y serán los que se recuperen para la TRA. Este método permite el aislamiento de espermatozoides móviles incluso en una muestra astenozoospérmica.

_{Figura. Representación esquemática de SU y CGD. Tomado de Baldini et al. Cells 2021, 10, 3566.}

Ninguna de estas técnicas permite identificar con total certeza aquellos espermatozoides con capacidad fecundante, ni genéticamente normales y teniendo en cuenta la tasa de éxito reproductivo actual, nos hace pensar que todavía existe un amplio margen de mejora y sugiere que el fallo en la consecución de un Recién Nacido Vivo (RNV) podría deberse a ciertas “anomalías ocultas” dentro del espermatozoide.

Por ello se buscan nuevos métodos de selección espermática que intentan valorar diferentes características de los espermatozoides con el fin de predecir el potencial fértil del varón y conseguir recuperar espermatozoides que den lugar al éxito reproductivo que en definitiva es conseguir la gestación y RNV.

Estas técnicas avanzadas de recuperación espermática se pueden clasificar en función de diferentes características: Densidad del esperma, Carga superficial de la membrana, Morfología, Motilidad, Integridad y proteínas de membrana y/o Integridad nuclear.

A continuación, vamos a desarrollar las características y aplicaciones de algunas técnicas avanzadas existentes actualmente:

TSE basadas en la Carga Superficial de Membrana:

Potencial Z: O electrocinético: describe la intensidad del campo eléctrico estático entre la superficie del espermatozoide y el medio en el que está suspendido. Los espermatozoides maduros tienen un potencial zeta que oscila entre -16 y -20 mV (carga negativa) por lo que son capaces de adherirse a una superficie cargada positivamente (tubos de plástico o cristal). Teóricamente los espermatozoides con el ADN fragmentado tienen una carga eléctrica más positiva y no se unirían a las superficies. La facilidad para realizar la separación de espermatozoides morfológicamente maduros con ADN íntegro y condensado, la rapidez y su bajo coste son las ventajas de este método. Entre los inconvenientes destaca su bajo rendimiento ya que se recuperan muy pocos espermatozoides por lo que no es de elección en muestras oligozoospérmicas. Además, dado que los espermatozoides de cromosoma X tienen más carga negativa que los de cromosoma Y, parece que hay una tendencia a seleccionar espermatozoides X. La validación clínica y el empleo de este método son limitados.

_{Figura. Representación esquemática del Potencial Zeta. La alta carga negativa en la membrana de la célula espermática madura reacciona con la carga positiva del tubo mientras que la fracción inmadura es separada. Tomado de Baldini et al. Cells 2021, 10, 3566.}

Electroforesis: El aislamiento de espermatozoides por electroforesis se basa en el tamaño y la carga eléctrica de los espermatozoides. Cuanto mayor es la electronegatividad, mejor es la calidad de los espermatozoides: morfología, capacitación e integridad del ADN. El sistema consiste en una cámara dividida en dos por un filtro de policarbonato unido a una membrana de poliacrilamida que permite el tránsito de electrólitos. La muestra se carga en una solución tampón y se aplica una corriente continua con un voltaje variable. El aislamiento de espermatozoides es rápido y eficiente incluso para muestras de biopsia testicular, consiguiendo separar selectivamente aquellos con mejor movilidad, vitalidad y morfología. Es un método rápido, fácil y no invasivo que ha demostrado ser tan efectivo como los gradientes de densidad en preparación del semen para FIV o ICSI y la tasa de fecundación, división embrionaria y desarrollo es similar. A pesar de la esperada mejoría de la calidad del ADN de los espermatozoides, aún tiene poca evidencia científica y los datos son insuficientes en relación a los RNV conseguidos.

_{Figura.  Esquema de una cámara de electroforesis para separación de espermatozoides.}

TSE basadas en la Morfología:

MSOME: Sperm Organelle Morphological Examination / IMSI: Intracytoplasmic Morphologically Selected Sperm injection: Está demostrado que la morfología espermática es un predictor útil en el éxito de las TRA y la buena integridad del núcleo espermático esta positivamente asociado con las tasas de fecundación y gestación, pero en este caso la valoración morfológica evalúa orgánulos de espermatozoides móviles a tiempo real y con gran aumento del microscopio hasta 6300x (habitualmente la selección de espermatozoides se realiza a una magnificación de 400x). Se proponen nuevos criterios morfológicos en los que se valoran: acrosoma, lámina postacrosomal, cuello, mitocondrias, flagelo y núcleo. Los espermatozoides con más vacuolas se relacionan con un empaquetamiento defectuoso de la cromatina y teratozoospermia convencional. Según los reportes la selección de espermatozoides simétricos, ovales, de cola recta, con núcleos fijos y transparentes y con menos del 4% de vacuolas permite conseguir tasas de hasta un 40% de éxito tras un fallo previo de ICSI. Los primeros trabajos con MSOME se publicaron en el año 2002 y proponían su empleo en teratozoospermias severas, fallos previos de ICSI, fallos de implantación y abortos de repetición. Los últimos estudios que han evaluado la experiencia en el empleo de MSOME y la IMSI han sugerido que los resultados tanto en gestación como en recién nacidos sanos son comparables a la ICSI convencional. Los principales inconvenientes de esta técnica son: el equipamiento sofisticado y costoso, la necesidad de contar con personal altamente especializado y la gran inversión de tiempo necesarios para procesar las muestras.

_{Figura.  Espermatozoides vivos observados a una magnificación 400X para ICSI A) y magnificación >6000X para IMSI B) y C). Presencia de vacuolas en B). Espermatozoide sin vacuolas en C). Tomado de Marci et al.}

Birrefringencia: Se basan en la desviación de la luz aplicada. Los espermatozoides maduros son anisotrópicos con birrefringencia que refleja un buen estado de salud, sugiriendo que cuanta más birrefringencia menos porcentaje de aneuploidías. Se analizan las diferentes partes del espermatozoide: núcleo, acrosoma, y flagelo, basándose en las propiedades anisotrópicas de las diferentes estructuras. La birrefringencia natural de la cabeza del espermatozoide puede ser atribuida al estado de la reacción acrosómica, donde los espermatozoides que no han reaccionado tienen birrefringencia en la cabeza entera, mientras que los que ya han sufrido reacción acrosómica solo muestran birrefringencia en la región postacrosomal, la tasa de implantación es significativamente superior con espermatozoides que ya han sufrido la reacción acrosómica. Además de requerir un equipamiento costoso aún necesita ser validada en la clínica.

_{Figura: Observación de cabeza de espermatozoides con luz polarizada (magnificación x630). A) Espermatozoide con morfología normal muestra birrefringencia total de la cabeza. B) Espermatozoide con morfología normal con birrefringencia parcial en la región postacrosomal. C) Presencia de vacuolas en un espermatozoide parcialmente birrefringente con morfología normal; la vacuola ocupa el 15% del volumen de la cabeza. D) Estructura vacuolar grande que cubre el 33% de una cabeza de espermatozoide no birrefringente. Tomado de Magli et al.}

Microespectrometría RAMAN:  La unión del microscopio confocal con un espectrómetro ofrece muchas posibilidades para el estudio y selección de espermatozoides. En la representación hiperespectral o imagen química del espermatozoide, se detecta la huella química de las diferentes partes: se distingue el núcleo de color rojo, las proteínas de color azul y la superposición de ADN y proteínas en verde. El ADN mitocondrial de la porción intermedia también se distingue en rojo. Puede aportar información detallada sobre la eficiencia del empaquetamiento del ADN de una sola célula examinando el espectro láser. Aún no se dispone de una base de datos suficiente de espectros químicos y para el empleo en la práctica clínica son necesarios más trabajos que confirmen el rango de seguridad de exposición al láser y la duración de la misma.

TSE basadas en la Motilidad:

Cámara de Microfluidos: Se utiliza en casos de alta fragmentación de ADN que se ha relacionado con alteraciones de la movilidad de los espermatozoides, menor capacidad de fecundación, menor calidad embrionaria, menor tasa de implantación y mayor tasa de aborto recurrente. Las cámaras de microfluidos tratan de mimetizar el paso de los espermatozoides a través del tracto reproductor femenino. Constan de un número variable de cámaras interconectadas por una red de microcanales. Al controlar la dinámica de fluidos, es posible imitar las condiciones fisiológicas de pH y temperatura del tracto genital femenino. Por lo tanto, potencialmente podríamos seleccionar espermatozoides con mayor motilidad a través de flujos, gradientes químicos o campos electroforéticos. En comparación con la centrifugación en gradiente de densidad clásica, la morfología y la motilidad de los espermatozoides seleccionados mejoran significativamente (98 % y 22 %).  Entre las ventajas que sin duda ofrece se encuentran la automatización y la reducción de los tiempos de diagnóstico y preparación. Desafortunadamente, el alto costo de la instrumentación y el bajo rendimiento de la muestra en términos de volumen representan las principales limitaciones.

_{Figura: Representación esquemática del sistema microfluídico. La fracción móvil de los espermatozoides son capaces de nadar a través del flujo y ser recogido en cámaras separadas (cámaras azules) mientras que los espermatozoides inmóviles (cabezas amarillas) y los desechos alcanzan la salida del sistema microfluídico (cámara oscura). Tomado de Baldini et al. Cells 2021, 10, 3566.}

TSE basadas en Proteínas de Membrana:

PICSI / HBA: Physiological ICSI / Hyaluronan binding assay: se basa en el estado de Maduración del espermatozoide. Los espermatozoides maduros tienen receptores para ácido hialuronico (AH) en la membrana que son indicadores de buen estado de salud del espermatozoide, reflejan menor tasa de aneuploidías, ausencia de fragmentación del ADN, ausencia de apoptosis y ausencia de retención citoplasmática. Se utilizan placas de AH que inmovilizan los espermatozoides maduros desprovistos de apoptosis y fragmentación del DNA, posteriormente se seleccionan los unidos para la ICSI. Teóricamente, estas características de selección positiva deberían traducirse en mayores tasas de fertilización y, en última instancia, en mejores resultados clínicos cuando se seleccionan espermatozoides positivos para HA para ICSI y fertilización. Sin embargo, los datos sobre HA son contradictorios. Algunos estudios han sugerido mejores tasas de implantación y gestación con una disminución de la posibilidad de abortos, pero aún se requieren estudios con mayor número de pacientes que confirmen estos datos.

MACS: Magnetic Activated Cell Sorting: Se utilizan Microbeads (MB) que son partículas coloidales paramagnéticas de 50 nanómetros, unidas covalentemente a anticuerpos o moléculas de unión que reconocen epitopos de interés produciendo posteriormente columnas de separación en un campo magnético dependiendo de las fracciones marcadas o no. Se ha visto que la apoptosis espermática está relacionada con la infertilidad masculina, se manifiesta por la externalización de la fosfatidilserina (PS) en la membrana del espermatozoide; se han unido los MB a un fosfolípido unido a proteína con alta afinidad por la PS llamado Anexxina V (AV) consiguiendo separar los espermatozoides con la membrana comprometida; de esta manera conseguiremos una fracción enriquecida con espermatozoides no apoptóticos. Según algunos estudios consigue un aumento significativo de las tasas de gestación, aunque existe controversia con respecto a la mejora de las tasas de RNV.

_{Figura: Espermatozoides pasando a través de la columna con anexina V. Aquellos capaces de pasar a través de la columna representa son los viables (cabezas verdes) mientras que la fracción apoptótica queda atrapada dentro de la columna (amarillos). Tomado de Baldini et al. Cells 2021, 10, 3566.}

Conclusión

A pesar de los avances en TRA en los últimos 40 años, sigue siendo un proceso relativamente ineficiente. Aunque todos estos métodos parecen mejorar la calidad de la muestra, no se ha demostrado de manera significativa, una mejora en los resultados clínicos que recomienden su aplicación en la rutina diaria en el laboratorio. Se requieren muchos más estudios para validar y verificar los resultados, que se traduzcan en seleccionar el mejor espermatozoide y el incremento de la tasa de recién nacidos vivos que es el objetivo final.

Bibliografía

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